(ni una referencia citada, los nombres de especies o géneros deben ir en cursiva, cuatro referencias al final para cumplir ....) inicio de la proteína erróneo.
Arbol filogenético de bacterias: Nuestro microorganismo (que aparece como QUERY) se encuentra en la rama de Rhodococcus. Se trata, por tanto, y apoyándonos en comparación en la base de datos de PubMed, de un representante de este género. En estas bases de datos se nos indica que con un 81% de homología (una identidad de 1011 sobre 1247) el microorganismo que tenemos se asemeja a Rhodococcus opacus. Por lo tanto podemos decir que se trata de Rhodococcus sp.
2.- Análisis informático de la secuencia mediante el programa ARTEMIS.
Proteínas codificadas por la secuencia (ORFs)
A continuación se especifican aquellos ORFs que contienen secuencias para proteínas conocidas o desconocidas, indicando la posición dentro del fragmento asignado. Se han obtenido a partir del análisis de los ORFs proporcionados por el programa ARTEMIS, utilizando la web del NCBI para realizar las pruebas de BLAST.
381-737: Gene for DnaA. 412-1521: Proteína de iniciación de la replicación cromosómica. 1089-1472: M. Smegmatis. Origino f replication and genes rpm,dnaA, dnaN, gnd, recF, gyrB and gyr A. 2265-3275: DNA polymerase III Beta subunit. 4269-4670: Putative 6-phosphoglunate dehydrogenase. 4513-5475: DNA replication and repair protein RecF. 5917-6528: Hypotetical protein RHA1_ro03670. 6580-7284: Hypotetical protein ROP_34880. 7515-8411: Phenoxybenzoate dioxygenase beta subunit. 8819-9403: Putative hydrolase. 9252-9593: Epoxide hydrolase. 9715-10854: Gene for DNA gyrase beta subunit. 12022-13122: DNA gyrase subunit A. 14586-15662: Hypotetical protein. 15763-16110: Multidrug resistant protein.
Elección de una o varias proteínas interesantes de la secuencia
Secuencia: DNA-directed DNA polymerase III beta subunit Rhodococcus sp. Esta es la proteina que vamos a estudiar en profundida.
Se encuentra entre la posición 2035 y la 3279 del fragmento que se me ha asignado.
Secuencia de amioácidos: La proteína empieza en MELGS.... porqué dice que la secuencia empieza después de un codon de fin.???
RSRVHCGRRPSAPTERNTRAMELGSMKFRVAREDFADSVAWVARSLPSRPPVPVLGGVLL
GADEQGLTVSGFDYEVSAQVRVSAEVTTTGQVLVSGKLLADITRALPNKPVDVTVDGTRV
LIACGSAKFSLPTMPVEDYPQLPTLPQQTGSLPVDLFSEAVSQVAVAAGKDDTLPMLTGI
RVEIEGTDVVLAATDRFRLAVRKLEWMPTAGDVTAAVLVPARTLSESAKTLGGNTLAPVE
LALGAGASVGTEGMLGIVADGRRTTTRLLDAEFPKFRQLLPAEHTAMATVTVAPLVDAIK
RVALVAERGAQVRLEFNSEGLVLSAGGDDAGRAEEALEADFQGEPLVIAFNPGYLIDGLN
SLHSERVTFGFTTPSRPAVLRPAGEEELERGESGTFAAPESDYIYLLMPVRLPG
3.- Análisis del gen que codifica para la/s proteína/s elegida/s.
Diseño de primers para la amplificación del gen/es por PCR
LEFT PRIMER CGCAGCCGTGTGCACTGCGGCCGCCG
RIGHT PRIMER AGTCGGGCCCTCGGCGTGGCCGTAGTCG
Diseño de primers para amplificar fragmentos internos del gen/es y comprobar si dicho gen/es son esenciales o no para el microorganismo.
De 300 a 400 pb.
LEFT PRIMER AGCGATGGAGCTTGGAAG RIGHT PRIMER AGGGAGAACTTGGCGCTAC
Amplifica 336 pb.
Otros
LEFT PRIMER AGCGATGGAGCTTGGAAG
RIGHT PRIMER GTAGTCCTCGACCGGCATC
Amplifica 361 pb
LEFT PRIMER AGCGATGGAGCTTGGAAG
RIGHT PRIMER CAGGGAGAACTTGGCGCTAC
De 500 a 600 pb
LEFT PRIMER GATGCCGGTCGAGGACTAC
RIGHT PRIMER CAGACCCTCGCTGTTGAAC
Amplifica 565 pb.
LEFT PRIMER GATGCCGGTCGAGGACTAC
RIGHT PRIMER AGACCCTCGCTGTTGAACTC
Amplifica 564 pb.
Mediante RNA antisentido, aprobechando(ojo con las faltas de ortografía) los sistemas Dicer/Risc (no se pueen decir cosas como estas en un trabajo sin explicarlo o sin dar una referencia) de las bacterias podemos hacer una interrupción génica y comprobar si el gen es esencial para el microorganismo. Si esto no funciona se puede hacer mutación dirigida por PCR, deleccionando parte del gen y comprobar si crecen las bacterias que han hibridado.
Primers Para realizar la delección de un fragmento para inactivar el producto génico. Los primers 1 y 4 son los elegidos por el programa de búsqueda de primers, mientras que el 2 y el 3 son primers diseñados a mano, complementarios, los cuales se encuentran en la parte central de la secuencia en la que se hará la delección. La secuencia seleccionada posee 336 pb en marco, por lo que la eliminación de esta no va a afectar al resto de genes que pueda haber aguas abajo del seleccionado, ni al codón de fin de este.
Primer 1: ACCGCTCGAGAATTCATGAGCGATGGAGCTTGGAAG En rojo está el sitio de restricción.
Primer 2: ACCTGCGACCTCGACTTACGCCGCCGCCGCCGCCGCGGGAGAACTTGGCGCTAC En rojo el sitio de restricción y en verde el TAG de 6 Histidinas.
Estudio de la/s proteína/s por bioinformática.
Se trata de una proteina citoplasmática. Por tanto, no posee segmentos transmembrana ni secuencias de transporte. No se observan, por tanto, péptidos lider.
Número de amino ácidos de la proteina: 414
Peso molecular: 43822.0
PI teórico: 4.97
Composición de amino ácidos:
Ala (A) 49 11.8% Arg (R) 31 7.5% Asn (N) 6 1.4% Asp (D) 22 5.3% Cys (C) 2 0.5% Gln (Q) 10 2.4% Glu (E) 30 7.2% Gly (G) 37 8.9% His (H) 3 0.7% Ile (I) 9 2.2% Leu (L) 47 11.4% Lys (K) 9 2.2% Met (M) 8 1.9% Phe (F) 14 3.4% Pro (P) 29 7.0% Ser (S) 25 6.0% Thr (T) 32 7.7% Trp (W) 2 0.5% Tyr (Y) 5 1.2% Val (V) 44 10.6% Pyl (O) 0 0.0% Sec (U) 0 0.0% (B) 0 0.0% (Z) 0 0.0% (X) 0 0.0%
Mutagénesis in vitro del gen/es que codifican para la/s proteína/s elegida/s.
Porqué ha elegido essa mutación? ATGAGCGATGGAGCTTGGAAGTATGAAGTTTCGCGTTGCTCGGGAGGACTTCGCCGACTCCGT
TACTCGCTACCTCGAACCTTCATACTTCAAAGCGCAACGAGCCCTCCTGAAGCGGCTGAGGCA
Primers para la mutación. En nuestro caso cambiamos Asp por Tyr.
ATGAGCGATGGAGCTTGGAAG Primer 1
GACGAGCAGGTACTGACGGTCTCCGGC Primer 2
CTGCTCGTCCATGACTGCCAGAGGCCG Primer 3
TTAGGGAGAACTTGGCGCTAC Primer 4
Diseño de primers para realizar fusiones génicas entre la/s proteína/s de interés con la proteína fluorescente verde para estudiar su localización celular o su concentración a lo largo del crecimiento del microorganismo.
Primers para realizar la fusión de las dos proteinas:
Primer 1: 5’- ATGAGCGATGGAGCTTGGAAG
Primer 2:5’-CTCCTTTACTCATGGGAGAACTTGGCGCTAC
Primer 3: 5’-GTAGCGCCAAGTTCT CCCATGAGTAAAGGAGAAG Primer 4: 5’- TTATTTGTATAGTTC
5.- Escritura de un informe en castellano de la actividad realizada.
RESUMEN:(ni una referencia citada, los nombres de especies o géneros deben ir en cursiva, cuatro referencias al final para cumplir ....)
Rhodococcus es una bacteria aerobia, no esporulada e inmóvil perteneciente al grupo de las gram positivas. Se trata de un género cercano a Mycobacterium y Corynebacterium.Algunos son patógenos, pero la mayoría son inocuos y viven en numerosos hábitats. Se ha iniiciado el estudio del genoma de un representante de este género debido a que su importancia radica en la capacidad de otras especies para producir esteroides bioactivos, acrilamida y ácido acrílico. Además es importante en el proceso de degradación de productos contaminantes y la biodesulfuración de los combustibles fósiles. Se ha estudiado un fragmento del genoma de esta bacteria, eligiendo el gen de la subunidad beta de la DNA polimerasa III para hacer un análisis más específico de este. Lo que nos permite determinar numerosos parámetros del crecimiento y la replicación de esta cepa, como paso previo a estudios centrados en las enzimas metabólicas de este microorganismo. Hemos analizado la secuencia génica, así como la protéica, determinando sus características y comparándolas con bases de datos de microorganismos cercanos.
INTRODUCCIÓN:
La DNApolimerasa III es una holoenzima que participa en el proceso de replicación de DNA. Está formada por 10 péptidos diferentes, alcanzando un peso molecular superior a los 600 kd. Su función es la síntesis de la mayor parte del DNA en el proceso de replicación. También posee actividad correctora de copia 5´à3´ exonuucleasa.
Está formada por 4 elementos diferentes: core polimerasa, subunidad beta y complejos g y t. El presente trabajo versa sobre el análisis y desarrollo de técnicas para el estudio de la subunidad beta de la DNA polimerasa III de Rhoodococcus sp., la cual actúa formando un anillo u orquilla en torno a la doble hélice, fijando esta al core de la enzima.
Se trata de un gen indispensable para el crecimiento del microorganismo, ya que sin ella no se puede realizar el grueso del proceso replicativo, al quedar inactivada la DNA polimerasa III.
MATERIALES Y MÉTODOS:
Para la obtención de la secuencia de DNA se han cultivado las cepas y aislado la molécula usando las instalaciones del departamento de Microbiología de la Universidad de León.Se ha empleado medio TSB o YEME líquido para crecer las bacterias en matraces.
Tras aislar el DNA y crear con él una genoteca se han enviado los distintos fragmentos a la unidad de secuenciación de la Universidad de León.
El análisis posterior se ha realizado mediante herramientas bioinformáticas, programas de tratamiento de secuencias genéticas y proteicas, bases de datos, etc. Estos aparecen referenciados en el cuerpo del trabajo cuando se ha considerado conveniente citarlos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
El resultado del estudio realizado es que la secuencia estudiada corresponde a un microorganismo del género Rhoodococcus el cual no se encuentra todavía en las bases de datos disponibles en Internet. Se trata de una secuencia de alto contenido en G+C, alrededor del 67%, lo que coincide con lo descrito en otras especies del mismo género.
El fragmento estudiado posee numerosas ORFs, a partir de las cuales, mediante el BLAST en la base de datos de NCBI se ha podido determinar que una importante cantidad de las codificantes lo son para proteinas que tienen que ver con la replicación u otros procesos del DNA. Así podemos encontrar la DNA girasa, tanto las subunidad A como la beta. La proteína RecF, de replicación y reparación del DNA. Y la proteína que hemos elegido para el estudio, la Subunidad beta de la DNA polimerasa III. Por ello podemos decir, que aunque hay otras proteinas en la secuencia, esta parece ser un fragmento donde se concentran proteinas que actúan sobre el DNA.
En cuanto a la secuencia elegida hemos diseñado primers para producir delecciones en ella. El resultado de este experimento, como no podía ser de otra forma, ha sido la completa ausencia de crecimiento de colonias. Hemos realizado mutaciones de un solo aminoácido para observar la respuesta en la funcionalidad de dicha proteína.
También se han realizado un experimento de fusión de la proteína seleccionada con la proteína fluorescente verde (GFP), para observar la localización “in vivo” de nuestra proteína dentro del microorganismo. El resultado ha sido que esta aparece en el citoplasma, como predecían los estudios bioinformáticos previos y los conocimientos que ya existían sobre dicha proteína.
AGRADECIMIENTOS:
A la Universidad de León por cedernos sus instalaciones. Al Ministerio de Educación y Ciencia por concederme la beca de ayuda a estudios universitarios. Al Dr. José A. Gil por impartir la asignatura y enseñarnos los conocimientos necesarios para realizar el presente trabajo. Por último a mis compañeros de asignatura que en ocasiones me han ayudado con las dificultades que he tenido.
REFERENCIAS:
Interaction of the sliding clamp beta-subunit and Hda, a DnaA-related protein.
Identification of specific amino acid residues in the E. coli beta processivity clamp involved in interactions with DNA polymerase III, UmuD and UmuD'.
Critical Reviews in Biotechnology
1994, Vol. 14, No. 1, Pages 29-73 , DOI 10.3109/07388559409079833 Biotransformations Catalyzed by the Genus Rhodococcus
A. Michael Warhurst and Charles A. Fewson
Department of Biochemistry, University of Glasgow, Glasgow, G12 8QQ, UK
(ni una referencia citada, los nombres de especies o géneros deben ir en cursiva, cuatro referencias al final para cumplir ....) inicio de la proteína erróneo.
Arbol filogenético de bacterias: Nuestro microorganismo (que aparece como QUERY) se encuentra en la rama de Rhodococcus. Se trata, por tanto, y apoyándonos en comparación en la base de datos de PubMed, de un representante de este género. En estas bases de datos se nos indica que con un 81% de homología (una identidad de 1011 sobre 1247) el microorganismo que tenemos se asemeja a Rhodococcus opacus. Por lo tanto podemos decir que se trata de Rhodococcus sp.
2.- Análisis informático de la secuencia mediante el programa ARTEMIS.
A continuación se especifican aquellos ORFs que contienen secuencias para proteínas conocidas o desconocidas, indicando la posición dentro del fragmento asignado. Se han obtenido a partir del análisis de los ORFs proporcionados por el programa ARTEMIS, utilizando la web del NCBI para realizar las pruebas de BLAST.
381-737: Gene for DnaA.
412-1521: Proteína de iniciación de la replicación cromosómica.
1089-1472: M. Smegmatis. Origino f replication and genes rpm,dnaA, dnaN, gnd, recF, gyrB and gyr A.
2265-3275: DNA polymerase III Beta subunit.
4269-4670: Putative 6-phosphoglunate dehydrogenase.
4513-5475: DNA replication and repair protein RecF.
5917-6528: Hypotetical protein RHA1_ro03670.
6580-7284: Hypotetical protein ROP_34880.
7515-8411: Phenoxybenzoate dioxygenase beta subunit.
8819-9403: Putative hydrolase.
9252-9593: Epoxide hydrolase.
9715-10854: Gene for DNA gyrase beta subunit.
12022-13122: DNA gyrase subunit A.
14586-15662: Hypotetical protein.
15763-16110: Multidrug resistant protein.
Secuencia: DNA-directed DNA polymerase III beta subunit Rhodococcus sp. Esta es la proteina que vamos a estudiar en profundida.
Se encuentra entre la posición 2035 y la 3279 del fragmento que se me ha asignado.
ATGCGCAGCCGTGTGCACTGCGGCCGCCGACCGTCCGCGCCTACCGAGAGGAACACCCGAGCG
ATGGAGCTTGGAAGTATGAAGTTTCGCGTTGCTCGGGAGGACTTCGCCGACTCCGTCGCC
TGGGTCGCGCGCAGCCTGCCGTCCCGGCCGCCCGTCCCCGTCCTCGGCGGTGTGCTGCTG
GGTGCGGACGAGCAGGGACTGACGGTCTCCGGCTTCGACTACGAGGTCTCTGCCCAGGTT
CGGGTCTCCGCGGAGGTCACGACCACCGGCCAGGTCCTGGTGTCCGGCAAGCTGCTCGCC
GACATCACCCGCGCGCTGCCCAACAAGCCGGTCGACGTCACCGTGGACGGCACCCGGGTG
CTCATCGCCTGCGGTAGCGCCAAGTTCTCCCTGCCCACGATGCCGGTCGAGGACTACCCG
CAGCTGCCGACGCTGCCGCAGCAGACCGGTTCACTGCCGGTGGACCTGTTCTCCGAGGCC
GTCAGCCAGGTCGCCGTCGCTGCCGGCAAGGACGACACCCTGCCGATGCTCACCGGCATC
CGCGTCGAGATCGAGGGCACCGACGTCGTCCTCGCGGCCACCGACCGATTCCGCCTCGCG
GTCCGCAAACTCGAGTGGATGCCCACCGCCGGCGACGTCACGGCCGCGGTGCTGGTGCCG
GCCCGCACGCTGTCGGAGTCCGCGAAGACCCTCGGCGGCAACACTCTGGCCCCGGTCGAG
CTGGCGCTCGGCGCCGGTGCGTCGGTCGGCACCGAGGGCATGCTCGGCATCGTCGCCGAC
GGCCGTCGCACCACCACCCGCCTGCTCGACGCCGAGTTCCCCAAGTTCCGTCAGCTGCTG
CCGGCCGAGCACACCGCGATGGCGACGGTGACGGTCGCCCCGCTGGTCGACGCGATCAAG
CGTGTGGCTCTCGTCGCCGAGCGCGGTGCCCAGGTGCGGCTCGAGTTCAACAGCGAGGGT
CTGGTCCTGTCCGCGGGCGGCGACGACGCCGGTCGGGCCGAGGAGGCGCTCGAGGCCGAT
TTCCAGGGCGAGCCGCTGGTCATCGCGTTCAACCCCGGCTACCTCATCGACGGTCTCAAC
TCGCTGCACTCCGAGCGTGTCACCTTCGGCTTCACCACCCCGAGCCGTCCCGCGGTGCTG
CGTCCGGCCGGCGAGGAAGAGCTCGAGCGCGGCGAGTCCGGGACCTTCGCGGCCCCCGAG
AGCGACTACATCTACCTGCTGATGCCGGTGCGGCTCCCGGGCTGATT
Secuencia en doble cadena:
ATGAGCGATGGAGCTTGGAAGTATGAAGTTTCGCGTTGCTCGGGAGGACTTCGCCGACTCCGT
TACTCGCTACCTCGAACCTTCATACTTCAAAGCGCAACGAGCCCTCCTGAAGCGGCTGAGGCA
CGCCTGGGTCGCGCGCAGCCTGCCGTCCCGGCCGCCCGTCCCCGTCCTCGGCGGTGTGCT
GCGGACCCAGCGCGCGTCGGACGGCAGGGCCGGCGGGCAGGGGCAGGAGCCGCCACACGA
GCTGGGTGCGGACGAGCAGGGACTGACGGTCTCCGGCTTCGACTACGAGGTCTCTGCCCA
CGACCCACGCCTGCTCGTCCCTGACTGCCAGAGGCCGAAGCTGATGCTCCAGAGACGGGT
GGTTCGGGTCTCCGCGGAGGTCACGACCACCGGCCAGGTCCTGGTGTCCGGCAAGCTGCT
CCAAGCCCAGAGGCGCCTCCAGTGCTGGTGGCCGGTCCAGGACCACAGGCCGTTCGACGA
CGCCGACATCACCCGCGCGCTGCCCAACAAGCCGGTCGACGTCACCGTGGACGGCACCCG
GCGGCTGTAGTGGGCGCGCGACGGGTTGTTCGGCCAGCTGCAGTGGCACCTGCCGTGGGC
GGTGCTCATCGCCTGCGGTAGCGCCAAGTTCTCCCTAA
CCACGAGTAGCGGACGCCATCGCGGTTCAAGAGGGATT
Secuencia de amioácidos: La proteína empieza en MELGS.... porqué dice que la secuencia empieza después de un codon de fin.???
RSRVHCGRRPSAPTERNTRAMELGSMKFRVAREDFADSVAWVARSLPSRPPVPVLGGVLL
GADEQGLTVSGFDYEVSAQVRVSAEVTTTGQVLVSGKLLADITRALPNKPVDVTVDGTRV
LIACGSAKFSLPTMPVEDYPQLPTLPQQTGSLPVDLFSEAVSQVAVAAGKDDTLPMLTGI
RVEIEGTDVVLAATDRFRLAVRKLEWMPTAGDVTAAVLVPARTLSESAKTLGGNTLAPVE
LALGAGASVGTEGMLGIVADGRRTTTRLLDAEFPKFRQLLPAEHTAMATVTVAPLVDAIK
RVALVAERGAQVRLEFNSEGLVLSAGGDDAGRAEEALEADFQGEPLVIAFNPGYLIDGLN
SLHSERVTFGFTTPSRPAVLRPAGEEELERGESGTFAAPESDYIYLLMPVRLPG
3.- Análisis del gen que codifica para la/s proteína/s elegida/s.
LEFT PRIMER CGCAGCCGTGTGCACTGCGGCCGCCG
RIGHT PRIMER AGTCGGGCCCTCGGCGTGGCCGTAGTCG
De 300 a 400 pb.
LEFT PRIMER AGCGATGGAGCTTGGAAG
RIGHT PRIMER AGGGAGAACTTGGCGCTAC
Amplifica 336 pb.
Otros
LEFT PRIMER AGCGATGGAGCTTGGAAG
RIGHT PRIMER GTAGTCCTCGACCGGCATC
Amplifica 361 pb
LEFT PRIMER AGCGATGGAGCTTGGAAG
RIGHT PRIMER CAGGGAGAACTTGGCGCTAC
De 500 a 600 pb
LEFT PRIMER GATGCCGGTCGAGGACTAC
RIGHT PRIMER CAGACCCTCGCTGTTGAAC
Amplifica 565 pb.
LEFT PRIMER GATGCCGGTCGAGGACTAC
RIGHT PRIMER AGACCCTCGCTGTTGAACTC
Amplifica 564 pb.
Mediante RNA antisentido, aprobechando(ojo con las faltas de ortografía) los sistemas Dicer/Risc (no se pueen decir cosas como estas en un trabajo sin explicarlo o sin dar una referencia) de las bacterias podemos hacer una interrupción génica y comprobar si el gen es esencial para el microorganismo. Si esto no funciona se puede hacer mutación dirigida por PCR, deleccionando parte del gen y comprobar si crecen las bacterias que han hibridado.ATGAGCGATGGAGCTTGGAAGTATGAAGTTTCGCGTTGCTCGGGAGGACTTCGCCGACTCCGT
TACTCGCTACCTCGAACCTTCATACTTCAAAGCGCAACGAGCCCTCCTGAAGCGGCTGAGGCA
CGCCTGGGTCGCGCGCAGCCTGCCGTCCCGGCCGCCCGTCCCCGTCCTCGGCGGTGTGCT
GCGGACCCAGCGCGCGTCGGACGGCAGGGCCGGCGGGCAGGGGCAGGAGCCGCCACACGA
GCTGGGTGCGGACGAGCAGGGACTGACGGTCTCCGGCTTCGACTACGAGGTCTCTGCCCA
CGACCCACGCCTGCTCGTCCCTGACTGCCAGAGGCCGAAGCTGATGCTCCAGAGACGGGT
GGTTCGGGTCTCCGCGGAGGTCACGACCACCGGCCAGGTCCTGGTGTCCGGCAAGCTGCT
CCAAGCCCAGAGGCGCCTCCAGTGCTGGTGGCCGGTCCAGGACCACAGGCCGTTCGACGA
CGCCGACATCACCCGCGCGCTGCCCAACAAGCCGGTCGACGTCACCGTGGACGGCACCCG
GCGGCTGTAGTGGGCGCGCGACGGGTTGTTCGGCCAGCTGCAGTGGCACCTGCCGTGGGC
GGTGCTCATCGCCTGCGGTAGCGCCAAGTTCTCCCTAA
CCACGAGTAGCGGACGCCATCGCGGTTCAAGAGGGATT
Primers Para realizar la delección de un fragmento para inactivar el producto génico. Los primers 1 y 4 son los elegidos por el programa de búsqueda de primers, mientras que el 2 y el 3 son primers diseñados a mano, complementarios, los cuales se encuentran en la parte central de la secuencia en la que se hará la delección. La secuencia seleccionada posee 336 pb en marco, por lo que la eliminación de esta no va a afectar al resto de genes que pueda haber aguas abajo del seleccionado, ni al codón de fin de este.
ATGAGCGATGGAGCTTGGAAG Primer 1
CCCGAACCTGGGCAGAG Primer 2
CTCTGCCCAGGTTCGGG Primer 3
TTAGGGAGAACTTGGCGCTAC Primer 4
Promotores obtenidos con el PromScan.
Los promotores deben situarse en la secuencia
4.- Análisis de la/s proteína/s elegida/s
Primers para mutación.
ATGAGCGATGGAGCTTGGAAG TATGAAGTTTCGCGTTGCTCGGGAGGACTTCGCCGACTCCGT
TACTCGCTACCTCGAACCTTCATACTTCAAAGCGCAACGAGCCCTCCTGAAGCGGCTGAGGCA
CGCCTGGGTCGCGCGCAGCCTGCCGTCCCGGCCGCCCGTCCCCGTCCTCGGCGGTGTGCT
GCGGACCCAGCGCGCGTCGGACGGCAGGGCCGGCGGGCAGGGGCAGGAGCCGCCACACGA
GCTGGGTGCGGACGAGCAGGGACTGACGGTCTCCGGCTTCGACTACGAGGTCTCTGCCCA
CGACCCACGCCTGCTCGTCCCTGACTGCCAGAGGCCGAAGCTGATGCTCCAGAGACGGGT
GGTTCGGGTCTCCGCGGAGGTCACGACCACCGGCCAGGTCCTGGTGTCCGGCAAGCTGCT
CCAAGCCC AGAGGCGCCTCCAGTGCTGGTGGCCGGTCCAGGACCACAGGCCGTTCGACGA
CGCCGACATCACCCGCGCGCTGCCCAACAAGCCGGTCGACGTCACCGTGGACGGCACCCG
GCGGCTGTAGTGGGCGCGCGACGGGTTGTTCGGCCAGCTGCAGTGGCACCTGCCGTGGGC
GGTGCTCATCGCC TGCGGTAGCGCCAAGTTCT CCCTAA
CCACGAGTAGCGGACGCCATCGCGGTTCAAGAGGGATT
Primer 1: ACCGCTCGAGAATTCATGAGCGATGGAGCTTGGAAG En rojo está el sitio de restricción.
Primer 2: ACCTGCGACCTCGACTTACGCCGCCGCCGCCGCCGCGGGAGAACTTGGCGCTAC En rojo el sitio de restricción y en verde el TAG de 6 Histidinas.
Se trata de una proteina citoplasmática. Por tanto, no posee segmentos transmembrana ni secuencias de transporte. No se observan, por tanto, péptidos lider.
Composición de amino ácidos:
Ala (A) 49 11.8% Arg (R) 31 7.5% Asn (N) 6 1.4% Asp (D) 22 5.3% Cys (C) 2 0.5% Gln (Q) 10 2.4% Glu (E) 30 7.2% Gly (G) 37 8.9% His (H) 3 0.7% Ile (I) 9 2.2% Leu (L) 47 11.4% Lys (K) 9 2.2% Met (M) 8 1.9% Phe (F) 14 3.4% Pro (P) 29 7.0% Ser (S) 25 6.0% Thr (T) 32 7.7% Trp (W) 2 0.5% Tyr (Y) 5 1.2% Val (V) 44 10.6% Pyl (O) 0 0.0% Sec (U) 0 0.0% (B) 0 0.0% (Z) 0 0.0% (X) 0 0.0%
Porqué ha elegido essa mutación?
ATGAGCGATGGAGCTTGGAAGTATGAAGTTTCGCGTTGCTCGGGAGGACTTCGCCGACTCCGT
TACTCGCTACCTCGAACCTTCATACTTCAAAGCGCAACGAGCCCTCCTGAAGCGGCTGAGGCA
CGCCTGGGTCGCGCGCAGCCTGCCGTCCCGGCCGCCCGTCCCCGTCCTCGGCGGTGTGCT
GCGGACCCAGCGCGCGTCGGACGGCAGGGCCGGCGGGCAGGGGCAGGAGCCGCCACACGA
GCTGGGTGCGGACGAGCAGGGACTGACGGTCTCCGGCTTCGACTACGAGGTCTCTGCCCA
CGACCCA CGCCTGCT CGTCCCTGACTGCCAGAGGCCGAAGCTGATGCTCCAGAGACGGGT
GGTTCGGGTCTCCGCGGAGGTCACGACCACCGGCCAGGTCCTGGTGTCCGGCAAGCTGCT
CCAAGCCCAGAGGCGCCTCCAGTGCTGGTGGCCGGTCCAGGACCACAGGCCGTTCGACGA
CGCCGACATCACCCGCGCGCTGCCCAACAAGCCGGTCGACGTCACCGTGGACGGCACCCG
GCGGCTGTAGTGGGCGCGCGACGGGTTGTTCGGCCAGCTGCAGTGGCACCTGCCGTGGGC
GGTGCTCATCGCCTGCGGTAGCGCCAAGTTCTCCCTAA
CCACGAGTAGCGGACGCCATCGCGGTTCAAGAGGGATT
Primers para la mutación. En nuestro caso cambiamos Asp por Tyr.
ATGAGCGATGGAGCTTGGAAG Primer 1
GACGAGCAGGTACTGACGGTCTCCGGC Primer 2
CTGCTCGTCCATGACTGCCAGAGGCCG Primer 3
TTAGGGAGAACTTGGCGCTAC Primer 4
ATGAGCGATGGAGCTTGGAAG TATGAAGTTTCGCGTTGCTCGGGAGGACTTCGCCGACTCCGT
TACTCGCTACCTCGAACCTTCATACTTCAAAGCGCAACGAGCCCTCCTGAAGCGGCTGAGGCA
CGCCTGGGTCGCGCGCAGCCTGCCGTCCCGGCCGCCCGTCCCCGTCCTCGGCGGTGTGCT
GCGGACCCAGCGCGCGTCGGACGGCAGGGCCGGCGGGCAGGGGCAGGAGCCGCCACACGA
GCTGGGTGCGGACGAGCAGGGACTGACGGTCTCCGGCTTCGACTACGAGGTCTCTGCCCA
CGACCCACGCCTGCTCGTCCCTGACTGCCAGAGGCCGAAGCTGATGCTCCAGAGACGGGT
GGTTCGGGTCTCCGCGGAGGTCACGACCACCGGCCAGGTCCTGGTGTCCGGCAAGCTGCT
CCAAGCCC AGAGGCGCCTCCAGTGCTGGTGGCCGGTCCAGGACCACAGGCCGTTCGACGA
CGCCGACATCACCCGCGCGCTGCCCAACAAGCCGGTCGACGTCACCGTGGACGGCACCCG
GCGGCTGTAGTGGGCGCGCGACGGGTTGTTCGGCCAGCTGCAGTGGCACCTGCCGTGGGC
GGTGCTCATCGCC TGCGGTAGCGCCAAGTTCT CCCTAA
CCACGAGTAGCGGACGCCATCGCGGTTCAAGAGGGATT
ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTT GAATTAGATGGTGATGTTAATG
TACTCATTTCCTC TTCTTGAAAAGTGACCTCAACAGGGTTAAGAACAACTTAATCTACCACTACAATTAC
CCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGG
GGGTTGCTTTTCTCTCTGGTGTACC AGGAAGAACTCAAACATTGTCGACGACCCTAATGTGTACCGTACC
ATGAACTATACAAATAA
TACTTGATATGTTTATT
Primers para realizar la fusión de las dos proteinas:
Primer 1: 5’- ATGAGCGATGGAGCTTGGAAG
Primer 2: 5’-CTCCTTTACTCATGGGAGAACTTGGCGCTAC
Primer 3: 5’- GTAGCGCCAAGTTCT CCCATGAGTAAAGGAGAAG
Primer 4: 5’- TTATTTGTATAGTTC
5.- Escritura de un informe en castellano de la actividad realizada.
RESUMEN: (ni una referencia citada, los nombres de especies o géneros deben ir en cursiva, cuatro referencias al final para cumplir ....)
Rhodococcus es una bacteria aerobia, no esporulada e inmóvil perteneciente al grupo de las gram positivas. Se trata de un género cercano a Mycobacterium y Corynebacterium.Algunos son patógenos, pero la mayoría son inocuos y viven en numerosos hábitats.
Se ha iniiciado el estudio del genoma de un representante de este género debido a que su importancia radica en la capacidad de otras especies para producir esteroides bioactivos, acrilamida y ácido acrílico. Además es importante en el proceso de degradación de productos contaminantes y la biodesulfuración de los combustibles fósiles.
Se ha estudiado un fragmento del genoma de esta bacteria, eligiendo el gen de la subunidad beta de la DNA polimerasa III para hacer un análisis más específico de este. Lo que nos permite determinar numerosos parámetros del crecimiento y la replicación de esta cepa, como paso previo a estudios centrados en las enzimas metabólicas de este microorganismo.
Hemos analizado la secuencia génica, así como la protéica, determinando sus características y comparándolas con bases de datos de microorganismos cercanos.
INTRODUCCIÓN:
La DNA polimerasa III es una holoenzima que participa en el proceso de replicación de DNA. Está formada por 10 péptidos diferentes, alcanzando un peso molecular superior a los 600 kd. Su función es la síntesis de la mayor parte del DNA en el proceso de replicación. También posee actividad correctora de copia 5´à 3´ exonuucleasa.
Está formada por 4 elementos diferentes: core polimerasa, subunidad beta y complejos g y t.
El presente trabajo versa sobre el análisis y desarrollo de técnicas para el estudio de la subunidad beta de la DNA polimerasa III de Rhoodococcus sp., la cual actúa formando un anillo u orquilla en torno a la doble hélice, fijando esta al core de la enzima.
Se trata de un gen indispensable para el crecimiento del microorganismo, ya que sin ella no se puede realizar el grueso del proceso replicativo, al quedar inactivada la DNA polimerasa III.
MATERIALES Y MÉTODOS:
Para la obtención de la secuencia de DNA se han cultivado las cepas y aislado la molécula usando las instalaciones del departamento de Microbiología de la Universidad de León.Se ha empleado medio TSB o YEME líquido para crecer las bacterias en matraces.
Tras aislar el DNA y crear con él una genoteca se han enviado los distintos fragmentos a la unidad de secuenciación de la Universidad de León.
El análisis posterior se ha realizado mediante herramientas bioinformáticas, programas de tratamiento de secuencias genéticas y proteicas, bases de datos, etc. Estos aparecen referenciados en el cuerpo del trabajo cuando se ha considerado conveniente citarlos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
El resultado del estudio realizado es que la secuencia estudiada corresponde a un microorganismo del género Rhoodococcus el cual no se encuentra todavía en las bases de datos disponibles en Internet.
Se trata de una secuencia de alto contenido en G+C, alrededor del 67%, lo que coincide con lo descrito en otras especies del mismo género.
El fragmento estudiado posee numerosas ORFs, a partir de las cuales, mediante el BLAST en la base de datos de NCBI se ha podido determinar que una importante cantidad de las codificantes lo son para proteinas que tienen que ver con la replicación u otros procesos del DNA. Así podemos encontrar la DNA girasa, tanto las subunidad A como la beta. La proteína RecF, de replicación y reparación del DNA. Y la proteína que hemos elegido para el estudio, la Subunidad beta de la DNA polimerasa III. Por ello podemos decir, que aunque hay otras proteinas en la secuencia, esta parece ser un fragmento donde se concentran proteinas que actúan sobre el DNA.
En cuanto a la secuencia elegida hemos diseñado primers para producir delecciones en ella. El resultado de este experimento, como no podía ser de otra forma, ha sido la completa ausencia de crecimiento de colonias.
Hemos realizado mutaciones de un solo aminoácido para observar la respuesta en la funcionalidad de dicha proteína.
También se han realizado un experimento de fusión de la proteína seleccionada con la proteína fluorescente verde (GFP), para observar la localización “in vivo” de nuestra proteína dentro del microorganismo. El resultado ha sido que esta aparece en el citoplasma, como predecían los estudios bioinformáticos previos y los conocimientos que ya existían sobre dicha proteína.
AGRADECIMIENTOS:
A la Universidad de León por cedernos sus instalaciones. Al Ministerio de Educación y Ciencia por concederme la beca de ayuda a estudios universitarios. Al Dr. José A. Gil por impartir la asignatura y enseñarnos los conocimientos necesarios para realizar el presente trabajo. Por último a mis compañeros de asignatura que en ocasiones me han ayudado con las dificultades que he tenido.
REFERENCIAS:
Interaction of the sliding clamp beta-subunit and Hda, a DnaA-related protein.
**Kurz M**, **Dalrymple B**, **Wijffels G**, **Kongsuwan K**.CSIRO Livestock Industries, Queensland Bioscience Precinct, St. Lucia Queensland Dominion 4067, Australia.
Identification of specific amino acid residues in the E. coli beta processivity clamp involved in interactions with DNA polymerase III, UmuD and UmuD'.
**Duzen JM**, **Walker GC**, **Sutton MD**.Annual Review of Microbiology
Vol. 46: 193-218 (Volume publication date October 1992)
(doi:10.1146/annurev.mi.46.100192.001205)
Critical Reviews in Biotechnology
The Biology and Genetics of the Genus Rhodococcus
W R Finnerty
Critical Reviews in Biotechnology
1994, Vol. 14, No. 1, Pages 29-73 , DOI 10.3109/07388559409079833
Biotransformations Catalyzed by the Genus Rhodococcus
A. Michael Warhurst
Department of Biochemistry, University of Glasgow, Glasgow, G12 8QQ, UK